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  • 职业洞悉一文看懂单细胞测序

  • 发布时间:2022-07-01 03:01:47 来源:bet9网址登录 作者:bet9网址多少

      现在大多数关于人类基因组、癌症或其它范畴的研讨,依然是从多个细胞水平进行的,试验效果往往是细胞集体基因表达的均值,或许只代表数量上占优势细胞的生命活动信息,而无法准确反映样本中细胞异质性的许多信息,疏忽了细胞间基因表达调控的差异性。

      传统高通量测序办法,难以运用于稀有循环肿瘤细胞的转录组剖析、人胚胎发生最前期分解特征研讨、肿瘤非均质性和微进化研讨等范畴。

      例如常常无法判别两个基因突变是否发生在一个癌症患者肿瘤细胞的同一个肿瘤亚克隆中,仍是发生在不同的肿瘤亚克隆中。

      跟着测序技能、细胞别离和全基因组扩增技能的展开,在单个细胞水平上对基因组进行测序的单细胞测序技能逐步鼓起,一方面处理了微量样品无法进行检测的难题,另一方面也更好地解析了不同细胞之间的遗传变异的异质性。

      单细胞测序即single cell sequencing(SCS),可以取得特定微环境下的细胞序列差异以便利研讨其功用差异等 1 。

      对个别细胞的DNA测序可以协助咱们了解例如在癌症中的小范围细胞的变异;进行RNA测序则有助于咱们了解和辨别不同的细胞类型与其表现的基因,对研讨发育生物学等有较大裨益。协助咱们在单个细胞水平上,对基因组、转录组以及表观基因组水平进行精准的研讨 2-3 。

      与传统的全基因组测序多细胞水平比较,单细胞测序不只丈量基因表达水平愈加准确,并且还能检测到微量的基因表达子或稀有非编码RNA,其优势是全方位和多层次的。

      自从2009年初次面世,在这十几年以来继续不断地展开。尤其是近几年,单细胞测序呈现了爆发式的展开和遍及。

      2011年 ,《Nature Methods》杂志将单细胞研讨办法列为未来几年最值得重视的技能范畴之一。

      2013年 ,《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得重视的六大范畴第一,《Nature Methods》杂志将单细胞测序的运用列为2013年年度最重要的办法学展开。

      2015年 ,以来跟着10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技能的呈现,完全降低了单细胞测序的本钱门槛。自此单细胞测序技能被广泛运用于根底科研和临床研讨,相应效果也备受CNS喜爱,文章如漫山遍野般一再呈现在高分杂志。

      2017年 ,10月16日,与 “人类基因组方案” 相媲美的 “人类细胞图谱方案” 第一批拟赞助的38个项目正式发布,引爆单细胞测序新年代。

      2018年 ,单细胞测序技能的研讨效果涉及到肿瘤微环境、免疫医治,动植物胚胎发育,心血管疾病的发生展开机制等很多范畴,单细胞检测新技能也是层出不穷。

      单细胞测序流程包含:单细胞的别离制备、遗传物质的提取扩增以及遗传物质的高通量测序。

      比较传统测序,单细胞测序需求先将安排或体液中的细胞群别离成单个细胞,而这也恰恰是难点之处。

      首要的技能包含梯度稀释法、显微操作技能、荧光激活细胞分选、微流控技能和激光捕获显微切开。

      选用战略一,挨个别离单细胞再别离建库测序,就像是把米一粒粒从谷仓里播出来,而面临一个安排样本上万的细胞数量,这样显然是无济于事,不只受本钱约束,终究通量也会十分低。

      这种战略就好像银行的取号排队体系:将不同的客户打上不同的符号,并分配特定的窗口,按需排队。很多的“大堂司理”水凝胶将不同的“核酸标签”编号交给不同的顾客,并带着顾客们一个个排队进入大厅处理“测序”事务。一次试验,就能测得数百上千个单细胞的信息。

      关于RNA(转录组mRNA)来说,会比较简单了解一些。因为mRNA测序前需求做反转录,那么咱们只需求在poly T引物的5’端参加barcode即可。详细可见下面的示意图:

      假如测序对象是DNA,比方全基因组,就需求用其他办法来加barcode。现在首要是经过一种经过改造的高效转座酶(transposase)Tn5来完成。

      假如单个细胞中的DNA和RNA含量无法到达测序要求,需求对其进行扩增。现在分为单细胞全基因组扩增和单细胞转录组扩增。

      单细胞全基因组扩增(WGA)是经过将单个细胞溶解得到微量基因组 DNA 进行高效地扩增,取得高掩盖度的单细胞基因。最常用的技能为有多重置换扩增技能(MDA)。

      单细胞转录组扩增,则需求经过PCR将mRNA反转录成cDNA。Smart和Smart-seq2 是现在常用的mRNA全长扩增技能。SMART用多聚 T 碱基作下流引物开端反转录,运用反转录酶SMARTscibeRT 酶,在转录的结尾延长出几个超越模板的 C 碱基,转录出c DNA带 3 个 G 碱基的上游引物进行扩增。Smart-seq2技能运用全基因组扩增技能中用到的 Phi29DNA 聚合酶的链置换和接连组成特性,对环化的 cDNA 进行高效扩增 6 。

      根据二代测序渠道的单细胞基因组测序技能(scWGS)作为一种功用强大的东西,可以在单细胞层面研讨全基因组水平的遗传变异,包含拷贝数变异(CNV)和单核苷酸变异(SNV)等,从而可用于研讨细胞间的遗传异质性、细胞谱系分解、以及克隆演化等问题。可是,二代测序渠道尽管具有测序准确度高的长处,可是其测序读长相对较短(150bp X2),现在已有的根据二代测序渠道的单细胞基因组测序技能更适用于检测基因组拷贝数变异(CNV)、短的刺进缺失(Indel,50bp)的检测依然具有很大的局限性。

      单细胞测序技能,可以提醒单个细胞的基因结构和基因表达状况,反映细胞间的异质性。跟着精准医治年代的到来,现已运用于肿瘤检测、胚胎发育、免疫细胞医治及干细胞分解等一系列生物医学的研讨和临床试验中,正成为生命科学研讨的焦点。

      跟着精准医治年代的到来,未来单细胞技能,将会有助于人类的科学研讨以及临床运用,尤其是在肿瘤、微生物、神经科学、免疫学等范畴,运用会越来越广泛。

      2021年6月15日,Cell杂志宣布了一篇经过单细胞剖析勘探肿瘤的血管选定研讨的文章。该研讨选用了单细胞转录组测序技能(scRNA-seq),对31964个具有AAT(抗血管生成)抗性小鼠的肺肿瘤血管内皮细胞(TECs)和周细胞进行了检测。效果显现试验组与健康对照组的TECs和周细胞的表达谱都十分类似。一起还发现基质重塑巨噬细胞有助于浸润性癌细胞的血管选定;M1样巨噬细胞亚型可使血管细胞坚持停止。该研讨重在表现对立VEGF(血管内皮成长因子) 阻断 AAT时,肿瘤血管选定的临床重要性,并且有助于确认肿瘤血管的细胞表型,从而在研讨按捺肿瘤重生血管生成,按捺肿瘤细胞的成长和搬运的道路上向前迈进了一大步 5 。

      2020年7月,北京大学谢晓亮团队在Cell上宣布了一篇关于新冠病毒特效药的文章。此项目首先从60名新冠恢复患者的血液中别离出B细胞,运用单细胞转录组+单细胞BCR测序技能对这些B细胞进行检测,筛选出8558种病毒蛋白结合抗体序列,并找出14株高活性的中和抗体。之后进行小鼠试验,终究成功筛选出一种十分有用的中和抗体BD-368-2。经试验证明,此中和抗体可以大幅度进步新冠治好率,缩短治好时刻,乃至可以供给短期的病毒免疫,在医治和防备方面都发挥重要作用 7 。

      2019年5月,Nature报导,经过对24名阿尔茨海默患者和24名正常人尸检大脑样本的8万个细胞进行单细胞转录组测序。研讨不只剖分出兴奋性和按捺性神经元,还剖析稀有的非神经元脑细胞,如少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。这些细胞类型中的每一种在阿尔茨海默病患者中都表现出显着的基因表达差异。其间,轴突再生和髓鞘构成相关的基因在阿尔茨海默症中表现出显着差异 8 。

      除此之外,单细胞测序也运用于“人类细胞图谱方案”展开、胚胎和安排器官发育研讨等研讨傍边。

      根据二代测序渠道的单细胞基因组测序技能(scWGS)作为一种功用强大的东西,可以在单细胞层面研讨全基因组水平的遗传变异,包含拷贝数变异(CNV)和单核苷酸变异(SNV)等,从而可用于研讨细胞间的遗传异质性、细胞谱系分解、以及克隆演化等问题。

      可是,二代测序渠道尽管具有测序准确度高的长处,可是其测序读长相对较短(150bp X2),现在已有的根据二代测序渠道的单细胞基因组测序技能更适用于检测基因组拷贝数变异(CNV)、短的刺进缺失(Indel,50bp)的检测依然具有很大的局限性。

      为了战胜二代测序渠道测序读长短的缺陷,三代测序技能应运而生。在曩昔的十年中,长读长单分子测序技能的呈现极大地促进了基因组学范畴的展开。可是人体一个单细胞中的基因组DNA只要6pg(0.000006微克)左右,而现在长读长单分子测序一般需求1微克以上的基因组DNA(相当于数十万个细胞的基因组DNA含量)作为开始样品,因此无法用于微量样品以及单细胞样品的基因组测序。

      为了处理以上难题,来自北京大学的汤富酬研讨组开发了一种高精度的根据单分子测序渠道的全新的单细胞基因组测序办法 9 。该办法运用优化后的Tn5转座反响,能从单个细胞中扩增出均匀长度约6kb的基因组DNA片段(测序读长比较于根据二代测序渠道的单细胞基因组测序技能增加了20倍)。测序后的数据中,发生的环化测序(circular consensus sequencing, CCS)片段的均匀读长在6kb左右, 最长可达43kb。

      现在,全球潜在科研商场体量现已到达130亿美元以上,单细胞测序技能的商场更以年均20%以上的速度逐年增加。单细胞剖析技能在临床和药物开发方面的运用远景更为宽广。

      现在,单细胞测序正如火如荼,在单个细胞层面让咱们在史无前例的水平了解转录组、免疫组和表观组的多样性。

      跟着测序技能不断飞速展开,在不久的将来,单细胞测序技能必定可以将精准医疗面向更宽广的空间,更多的患者可以享用负担得起的特异性高效疗法,进步医治功率和医治进程的体会。在人类健康的舞台上开放愈加绚烂的光辉。

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